Cara pemeriksaan :
Ambil telur dalam keadaan terbaring. Buka selotip pada lubang
ruang udara, lalu siapkan gunting yang steril. Salah satu ujung gunting
tersebut dimasukkan ke dalam lubang udar, lalu gunting sekelilingnya dan semua
isi telur yang akan jatuh dan CAM aka tertinggal pada kulit telur yang
terpegang. Balikkan CAM yang tertinggal, lalu ambil dengan pinset yang steril,
letakkan dalam cawan petri , lalu amati. Jika virusnya positif ( + ), maka akan
terlihat pocks atau plaques.
Sifat pocks atau plaques dari beberapa virus :
- Sifat pocks virus Variola
Bentuk bundar, diameter 1 mm, berwarna putih
keruh, menonjol pada permukaan CAM.
- Sifat pocks virus Vacinia
Berwarna putih jernih, berukuran besar, tidak
begitu menonjol pada permukaan CAM.
- Sifat pocks virus Cowpox
Ukurannya sama denga pocks virus Vaccinia,
warnanya putih yang di tengahnya terdapat warna merah, karena adanya
perdarahan.
- Sifat virus Fowlpox
Ukurannya jauh lebih besar dari pocks virus
Vaccinia, warnanya sama dengan pocks visus vaccinia tapi lebih menonjol pada
permukaan CAM.
- Sifat plaques virus Herves Simplex
Warnanya sama dengan pocks Vaccinia, tapi
sama sekali tidak menonjol pada permukaan CAM, dan ukuranya lebih kecil dari
pocks Variola.
2. Cara penyuntikan intra
allantois
Pada umumnya digunakan telur berembrio berumur 10-11 hari.
Telur diperiksa di kamar gelap. Ruang udara diberi tanda dengan pensil.
Lihatlah pembuluh darah pada tempat disekitar 2 mm dibawah ruang udara, berilah tanda pada tempat yang tidak
ada pembuluh darahnya. Kemudian dibor dengan alat bor steril. Pada tempat yang
telah diberi tanda tadi., yaitu 1-2 mm di bawah ruang udara, bor sampai
menembus selaput kulit telur yang ada di bawahnya.
Bahan yang akan diperiksa diisap dengan spuit steril, lalu
suntikkan sebanyak 0.1-0,2 mL pada lubang tadi sedalam ± 0..5 cm, lalu lubang
ditutup dengan selotip beri nomor dan tanggal, lalu eramkan pada suhu 35˚C
selama 2 sampai 3 X 24 jam dalam keadaan berdiri.
Cara membongkar telur
Seluruh daerah ruang udara dibersihkan dengan kapas beralkohol.
Ambil gunting yang steril, lalu buat lubang dengan ujung gunting pada bagian
tengah ruang udara dengan diameter kuang lebih 2 cm. Bila ada kulit telur yang
terjatuh, ambil dengan pinset steril sampai bersih. Kemudian dengan pipet
pasteur yang steril tusuk selaput kulit telur melelui lubang tadi, lali isap
cairan allantoisnya, kumpulkan pada tabung sampai semua cairan allantois tadi
habis.
Virus yang biasa disuntikkan dengan cara ini adalah : Virus
influenza, virus Herves Simplex, dan virus Mumps.
3. Cara penyuntikkan intra
amnion.
Biasanya dipakai telur berembrio berumur 10-11 hari. Telur
diperiksa di kamar gelap, beri tanda pada ruang udara,.Seluruh daerah atas
ruang udara dibersihkan dengan kapas alkohol. Telur di tempatkan berdiri,
dengan gunting yang steril dibuat lubang dengan diameter 1-1,5 cm. Potongan
kulit telur dibersihkan dengan pinset steril. Amil minyak mineral yang telah
steril dengan pipet steril, lalu teteskan 1-2 tetes minyak tadi tepat diatas
selaput kulit telur. Goyangkan sampai rata. Minyak mineral akan membuat selaput
kulit telur menjadi transparan sehingga semua isi telur dapat terlihat.Ambillah
telur yang akan disuntikkan dengan spuit steril, lalu balikkan dan ditarik ke
bawah agar ada udara masuk, lalu suntikkan jarum ke dalam telur ke arah mata
embrio atau di bawah sayap embrio ( ruang amnion ). Yang pertama disuntikkan
adalah udaranya saja, maka akan tampak gelembung udara bergerak bila telur
udara digoyangkan, sputi jangan dicabut. Bila gelembung udara hilang maka
penyuntikan salah.Jika ini terjadi maka
spuit dicabut kembali lalu dibalikkan dan isap udara lalu disuntikan
kembali seperti semula, jika gelembung udara tetap bergerak dan tidak hilang
berarti penyuntikan tepat.Jarum jangan dicabut, tapi suntikan virusnya 0,1-0,2
ml. Setelah itu jarung dicabut, lalu tutup lubang dengan selotip. Beri nama, nomor dan tanggal, lalu eramkan
pada suhu 37˚C selama 2 x 24 jam.dalam keadaan berdiri.
Cara membongkar telur
Buka selotip dengan pinset yang tajam dan steril. Selaput kulit
telur dirobek dengan pipet pasteur. Mula-mula tusuk menembus kearah allantois, isap cairannya dan masukkan
ke dalam tabung. Ini dilakukan dengan keadaan telur berdiri, lalu telur
dibaringkan. Ambil pipet baru, kemudian keluarkan embrio yang dikelilingi
kantong yang jernih melalui lubang yang ditusuk sampai menonjol ke luar. Jaga
jangan sampai keluar semuanya. Dengan pipet tadi tusuk cairan amnionnya
sampai habis.
Contoh virus yang ditanam secara
intra amnion :
§ Virus
influenza
§ Virus
Herves Simpex
§ Virus
Mumps
4.
Cara penyuntikan intra yolk sac
Untuk
cara ini pilih umur telur dimana yolk sacnya masih besar, jadi embrionya masih
muda,yaitu sekitar 5-6 hari. Karena embrionya masih kecil, letaknya pun masih
belum menentu.
Periksa
telur di kamar gelap, ruang udara diberi tanda. Telur dibersihkan dengan kapas
beralkohol. Buat lubang dibagian tengan ruang udara. Suntik dengan jarum no 23(
panjangnya sekitar 4,5 cm ) sebanyak 0.5-1.0 ml virus. Setelah penyuntikan
lubang ditutup denagn selotip, eramkan 35 C selama 3- 8 hari tergantung dari
jenis virus yang ditanam. Beri nama,tanggal serta nomor.
Cara membongkar telur
Gunting
dengan gunting steril lubang udara dengan garis tengah 1 cm. Selaput kulit luar
dirobek dengan pinset yang steril. Cairan amnion diisap . Kuning telur diisap
dengan pipet lslu disimpan untuk diperiksa.
Virus
yang ditanam dengan cara ini adalah : Virus Javanese B Encephlitis, Rickettsia,
Trachoma, Lymphogranulomavnereum.
C.
Biakan jaringan ( Tissue culture)
Tersedianya sel-sel yang
dapat dibiak in vitro telah membantu identifikasi dan pembiakan virus yang baru
diisolasi dan yang telah dikenal.
Ada tiga tipe dasar biakn
jaringan , yaitu :
§ Biakan
jaringan primer, dibut dengan menyebarkan sel dari jaringan tuan rumah. Umumnya
sel-sel ini tidak sanggup tumbuh lebih dari beberapa kali pemindah biakan,
sebagai biakan sekunder.
§ Strain
sel diploid adalah biakan sekunder yang telah mengalami perubahan yang
memungkinkan sel-sel tersebut dibiak terbatas, tetapintetap memiliki pola
kromosom normal.
§ Garis
sel berkesinambungan, adalah biakan sel yang sangguo untuk tumbuh lebih lama
dan berasal dari strain sel atau jaringan ganas. Biakan sel demikian selalu
memiliki jumlah kromosom yang sudah berubah dan tidak teratur.
Biakan
jaringan ini bisa berasal manusia atau hewan. Jaringan normal manusia yang
dibuat biakan jaringan adalah otot,sel, amnion dan lain-lain. Sedangkan
jaringan yang adnormal adalah dari tumor-tumor yang ganas dan tumor-tumor yang
tidak ganas.
1.
Cara pembuatan biakan jaringan
Ada dua cara pembuatan biakan
jaringan yaitu cara A dan cara B.
Cara A
Misalnya kita akan membuat
biakan jaringan ginjal kera.
Kera dibunuh dengan alat-alat steril, lalu ginjalnya
dikeluarkan.Simpai yang meliputi ginjal dibuang. Bagian dalam ginjal berisi
lemak, dibuang. Yang diperlukan adalah bagian luar dari ginjal yang disebut
cortex. Bagian cortex tersebut dipotong kecil-kecil dengan gunting steril, lalu
masukkan ke dalam cawan petri, cuci dengan larutan Haksyang steril supaya bersi
dari darah. Masukkan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi larutan tripsin
0.25-0.35%. Tripsin tersebut harus bersuhu 37 C dimana pada suhu tersebut
tripsi mrmpunyai daya penghancuran jaringan antar sel dan daya penguraian
sel-selnya yang maksimal. Bila suhu lebih tinggi sel-sel akan rusak.
Jaringan diolah dengan larutan tripsin dengan alat yang
dapat diputar. Caiaran jaringan sel akan menetes ke luar. Masukkan ke dalam
erlenmeyer yang telah disediakan dalam suatu tempat yang berisi esbatu.
Selanjutnya suspensi tripsi dan jaringan diputar dengan
sentrifuge dengan kecepatan 5000-10000 rpm. Cairannya dibuang,endapannya dicuci
dengan larutan Hanks paling sedikit 3 kali pencucian.
Setelah pencucian selesai
endapan sel ditempatkan pada medium yang diperlukan. Setelah dicampur,lalu dibagi-bagikan
dalam tabung-tabung., simpan pada suhu 37 C dalam keadaan miring.
Setelah satu minggu, lihat dibawah mikroskop daerah yang
miring tadi. Maka akan terlihat lapisan sel yang merata yang disebut monolayer,
sel berbentuk seperti kumparan dengan dengan
masing-masing intinya.
Cara B
Kera disuntik dengan obat tidur ( obat bius), lalu diikat,
dinding perut kera disayat, lalu cari ginjalnya. Cairan triosin sitrat
dimasukkan ke dalam pembuluh darah serta langsung memasuki ginjal, kemudian
menghancurkan jaringan-jaringan antar sel di dalam ginjal tersebut. Cairan ini
akan ke luar dari ginjal melalui vena cava. Setelah cairan tripsin sitrat habis
kedua ginjal kera tersebut diambil. Ginjal lalu diolah seperti cara A.
Biakan jaringan yang berasal
ari manusia maupun hewan terdiri dari :
a.
Primary Cell Culture
b.
Stable Cell Line
1.
Primary Cell Culture
Adalah sel-sel yang dibuat
langsung dengan cara pembuatan biakan jaringan tersebut ( cara A atau cara B ).
Misalnya :
§ Biakan
jaringan ginjal kera
§ Biakan
jaringan ginjal kelinci
2.
Stable Cell Line
Stable
Cell Line diperoleh dengan passage
primary cell ( sel primer ), sehingga sifat sel tetap tidak berubah.
Contohnya :
§ Sel
He La
§ Sel
FL, berasal dari jaringan amnion manusia
§ Sel
BHK, berasal dari hamster yang berumur 2 minggu, lalu dipassage beratus-ratus
kali.
§ Sel
KB, berasal dari jaringan kanker hidung.
2.
Tanda-tanda bahwa virus ada atau tumbuh dalam
biakan jaringan adalah sebagai berikut :
a.
Adanya Cpe, yaitu mula-mula sel berbentuk kumparan,
kemudian berubah menjadi bentuk bulat berkelompok, inti berubah menjadi besar
dan struktur inti menjadi kasar dan bila dilihat dibawah mikroskop sebagian
inti terlihat lebih gelap.
b.
Adanya penghambatan dalam metabolisme sel biabak
jaringan atau kegagalan pembentukan asam dalam biakan jaringan.
c.
Pembentukan antigen dalam biakan
jaringan,misalnya antigen hemaglutinin, atau antigen ikatan komplemen, dapat
dibentuk tergantung dari jenis virusnya.
d.
Terjadi hemadsorpsi di dalam biakan jaringan yang bisa terjadi
tanpa adanya cpe atau bisa terjadi mendahului cpe dalam biakan jaringan.
Yang dimaksud dengan hemadsorpsi adalah penyerapan
atau pengikatan dari pada sel-sel darah merah dalam konsentrasi tertentu oleh
sel-sel biakan jaringan yang mengandung virus,sehingga tampak eritrosit
mengelilingi sel-sel yang berisi virus seperti untaian kalung mutiara.
Abovirus tidak dapat membentuk cpe dalam biakan jaringan ginjal
kera,tapi dapat menunjukan hemadsorpsi. Biakan jaringan ginjal kera Rhesus
ditanami virus arbovirus, lalu dieramkan pada suhu 37 C selama 1 minggu.
Hasilnya cpe negatif ( - ) lalu ditambahkan suspensi eritrosit angsa 0.5%,
goyangkan supaya eritrosit merata dalam biakan jaringan, eramkan pada suhu 37 C
selama 24 jam lalu lihat di bawah mikroskop. Maka akan terlihat eritrosit
seperti untaian kalung mutiara mengelilingi sel yang mengandung
virus.Hemadsorpsi (+), hal ini menunjukkan virus tersebut tumbuh dalam sel.
e.
Adanya interferensi, yaitu daya pencegahan virus
kedua kedalam biakan jaringan karena biakan jaringan sudah mengandung virus,
walaupun virus yang kedua adalah sejenis dengan virus yang pertama.
Ada dua kemungkinan
terjadinya interferensi yaitu :
1.
Virus yang pertama masuk,lalu merangsang sel
untuk membentuk interferon yang dapat mencegah pemasukan virus kedua, walaupun
virus yang kedua adalah sejenis dengan virus yang pertama.
2.
Virus pertama merubah metabolisme dan merubah
permukaan sel sehingga virus kedua tidak bisa masuk.
Interferon
Interferon
adalah suatu virus inhibitor yang dibentuk oleh sel hewan atau sel biakan
jaringan bila dimasuki oleh virus.
Interferon merupakan suatu protein ynag
bersifat asam, pH antara 2-3, dibentuk setelah 12-48 jam virus maksimal di
dalam sel.
Jumlah interferon yang dibentuk oleh sel
berbeda-beda tergantung dari jenis virus itu sendiri.
Virus yang pertumbuhannya cepat , sel yang
dihinggapinyaakan membentuk interferon dalam jumlah kecil, sedangkan virus yang
sifat pertumbuhannya lambat maka sel yang dihinggapinya akan menghasilkan
interferon dalam jumlah besar. Bila
virus yang pertumbuhannya cepat dipanaskan atau disinari dengan sinar UV, maka
virus tadi akan merangsang sel yang dihinggapinya sehingga mempunyai daya
pembentukan interferon dalam jumlah besar.
3.
Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan virus dalam
biakan jaringan
a.
Suhu
Biakan jaringan biasa hidup
pada suhu 40-41 C ,tapi bila biakan jaringan sudah ditanami virus ,maka virus
hanya bisa hidup pada suhu 36-37 C. Dan bila suhu lebih kecil dari 36-37 C
,pertumbuhan virus sangat lambat atau tidak tumbuh sama sekali.
b.
pH atau keseimbangan asam basa
Virus hidup dalam biakan
jaringan pada pH 7-7.4. Bila pH lebih kecil dari 6 virus akan mati. Untuk
mencegah penurunan pH pada biakan
jaringan dapat dilakukan :
1.
Medium biakan jaringan diberi glukosa,sebab
glukosa dapat menurunkan pH
2.
Medium biakan jaringan dapat ditambahkan NaHCO3
atau agak dibasakan.
c.
Keadaan biakan jaringan
Cara penyimpanan biakan
jaringan berpengaruh terhadap pertumbuhan virus. Biakan jaringan dapat
diletakkan miring atau diputar. Ada beberapa virus yang pertumbuhannya subur
dalam keadaan memutar dalam alat tertentu.
d.
Jenis biakan jaringan dan suspensi/medium biakan
jaringan serta jenis virus.
Misal ; Se He La + dengue
,medium Eagle+5% serum anak sapi,maka cpe negatif
Sel LLC – MK2+Dengue,medium
Eagle +3% serum sapi, maka cpe positif.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar